Воскобойникова И.В., Колхир В.К., Сокольская Т.А., Быков В.А., Сакович Г.С.,
Багинская А.И., Лескова Т.Е., Багирова В.Л.
ЗАО “ФПК ФармВИЛАР”, ВНИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР), Москва, Россия

В условиях эксперимента были изучены некоторые фармакологические свойства комплексного растительного препарата “Ангионорм” (сухой экстракт), предназначенного для лечения заболеваний связанных с сосудистыми нарушениями, такими как повышение агрегации тромбоцитов, нарушение проницаемости капилляров и т.п. Ангионорм обладает выраженной антиагрегационной активностью: в условиях in vitro (0,5-5 мг/мл) он подавляет коллаген- и АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов (АТ) человека в 1,7-15,7 раз, а в условиях in vivo (100 мг/кг, внутрь, кролики) - в 1,5-3,5 раза. Препарат обладает благоприятным сочетанием капилляропротективных и противовоспалительных свойств: в дозах 20 и 100 мг/кг снижает проницаемость капилляров кожи крыс на 66,2 и 94,4 %; уменьшает воспалительный отек лап у мышей и объем экссудата при экспериментальном перитоните у крыс на 27-53,9%. Показаны анальгетическая, диуретическая и гастропротективная активности Ангионорма.

Ключевые слова: Ангионорм, антиагрегационные, противовоспалительные, ангиопротективные, анальгетические, диуретические, гастропротективные свойства

Тромбозы и тромбоэмболии продолжают оставаться одной из наиболее актуальных, далеко не решенных, проблем современной медицины [1]. В качестве тромболитиков и средств профилактики тромбообразования в настоящее время применяются лекарственные препараты, оказывающие влияние на разные звенья системы гемостаза, как раздельно, так и в различных сочетаниях [2-4]. При этом антиагрегационная терапия является неотъемлемой частью патогенетической терапии заболеваний сердечно-сосудистой системы [5]. В патогенезе многих, в том числе широко распространенных заболеваний (хроническая венозная недостаточность, атеросклероз, некоторые энцефалопатии, нефро- и ретинопатии и др.) нарушения в системе гемостаза сочетаются с изменениями в сосудистой стенке. Взаимосвязь и взаимозависимость этих изменений обусловливают усиление патологического процесса с развитием тяжелых осложнений. Поэтому в лечении такого рода патологии необходимо применение как средств, корректирующих гемостаз, так и оказывающих нормализующее венотонизирующее влияние на сосудистую стенку, ангиопротекторов (например, препараты из листьев Гинкго билоба) [6]. Однако эффективность лекарственного средства в каждом конкретном случае определяется не только выраженностью его специфического действия, значение имеет и общий профиль его биологической, в частности, фармакологической активности. В последние годы для коррекции различных сосудистых нарушений активно используются растительные ангиопротекторы на основе экстракта из плодов и семян каштана конского (эскузан, эсфлазид, эсцин и др.), однако эти препараты слабо влияют на агрегацию тромбоцитов [7-9].

С целью получения лекарственного средства, обеспечивающего многостороннее положительное влияние на патологические состояния - заболевания с выраженной сосудистой недостаточностью и нарушениями в системе гемостаза, - ЗАО “ФПК ФармВИЛАР” на базе ВНИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) разработан фитопрепарат “Ангионорм”. Ангионорм представляет собой сухой экстракт, получаемый из смеси лекарственного растительного сырья, содержащей семена (плоды) конского каштана обыкновенного, корни солодки, плоды шиповника и боярышника.

Настоящая работа содержит результаты экспериментального фармакологического изучения Ангионорма.

Все исследования проводили со стандартизованными образцами Ангионорма.

Исходя из химического состава и свойств экстракта, его подлинность характеризуется качественными реакциями на флавоноиды, аскорбиновую кислоту, дубильные вещества и сапонины: на линию старта хроматографической пластинки “Silufol” размером 7,5´ 15 см наносят 0,03 мл рабочего раствора в виде полосы длиной 3 см и в точку 0,005 мл спиртового раствора рабочего стандартного образца (РСО) рутина. Пластинку высушивают в сушильном шкафу при температуре 100  ^° С в течение 5 мин и помещают в хроматографическую камеру, предварительно насыщенную в течение 1 ч смесью растворителей: спирт этиловый 95 % - толуол - хлороформ - кислота уксусная в соотношении 15 : 20 : 5 : 10. Когда фронт растворителей дойдет до края пластинки, её вынимают из камеры и сушат в сушильном шкафу при температуре 100 ° С в течение 5 мин. Затем пластинку обрабатывают 20 % спиртовым раствором n-толуолсульфокислоты и сушат в сушильном шкафу при температуре 100 ° С в течение 10 мин. На пластинке должны проявиться пятна: с R_f ~ 0,89 ± 0,04 (R_s=3,07± 0,14) жёлтого цвета (солодка), R_f ~ 0,52 ± 0,03 (R_s=1,79 ± 0,10) жёлтого цвета (солодка), R_f ~ 0,32 ± 0,03 (R_s=1,10 ± 0,10) жёлтого цвета (солодка), R_f ~ 0,18 ± 0,03 (R_s=0,62 ± 0,10) темно-коричневого цвета (шиповник и боярышник), R_f ~ 0,12 ± 0,02 (R_s=0,41 ± 0,07) узкая полоса коричневого цвета (боярышник), R_f ~ 0,06 ± 0,02 (R_s=0,21 ± 0,07) зеленовато-коричневого цвета (каштан конский) и пятно РСО рутина желто-зеленого цвета с R_f ~ 0,29.

Количественно спектрофотометрическим методом определяют содержание суммы флавоноидов в пересчете на авикулярин (не менее 0,5 %).

Некоторые экспериментальные исследования специфической фармакологической активности Ангионорма проводили в сравнении с Эскузаном, близким по фармакологическому действию растительным препаратом, обладающим венотонизирующими и противовоспалительными свойствами. Препарат перед началом экспериментов растворяли в дистиллированной воде или физиологическом растворе (0,9% раствор хлористого натрия). Контрольные животные получали в адекватном количестве и при том же пути введения растворитель (вода или физиологический раствор). Каждая группа опытных, контрольных или интактных животных формировалась не менее чем из 10-ти особей.

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента.

Антиагрегационные свойства Ангионорма изучали в условиях опытов in vitro и in vivo в лаборатории патологии и гемостаза ГНЦ РАМН (заведующий – профессор В.А.Макаров). Эксперименты in vitro были выполнены с использованием крови доноров, которую получали путем пункции кубитальной вены и стабилизировали 3,8%-ым раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. В экспериментах in vivo использовали кроликов обоего пола массой 2,5-3,5 кг. У кроликов образцы крови забирали из краевой вены уха животного. Для приготовления богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугировали в течение 10 минут при 1000 об/мин, после чего верхний слой плазмы переносили в другую пробирку, а остаток повторно центрифугировали в течение 20 минут при 3000 об/мин с целью получения плазмы, бедной тромбоцитами. Агрегацию тромбоцитов исследовали на агрегометре фирмы “Chrono-Log Corporation” (США) по методу G.G.V. Born (1962) [10]. С этой целью в кювету прибора помещали 450 мкл богатой тромбоцитами плазмы, используя в качестве оптического контроля такой же объем плазмы, не содержащей тромбоцитов. О степени агрегации судили по максимальной величине падения оптической плотности после окончания реакции (Аmax) по сравнению с исходной величиной. В качестве проагрегантов использовали АДФ (Boehringer Mannheim, Австрия) в конечной концентрации 1х10^-5 М и коллаген (“Ренам”, Россия) в конечной концентрации 50 мкг/мл.

Для оценки антиагрегационных свойств препарата in vivo Ангионорм вводили кроликам per os ежедневно в течение 14 суток в дозе 100 мг/кг веса животного. Кровь для исследования забирали до начала эксперимента, через 1, 7 и 14 суток введения, а также через 7 суток после последнего введения препарата. Для выявления влияния Ангионорма на агрегацию тромбоцитов in vitro раствор данной субстанции в концентрациях 0,1-5,0 мг/мл вводили в кювету агрегометра, содержащую богатую тромбоцитами плазму. Полученную смесь инкубировали в течение 5-и минут при 37⁰С, после чего кювету помещали в гнездо агрегометра и процесс инициировали добавлением проагреганта.

Противовоспалительные свойства Ангионорма изучали на модели острого воспалительного отека у мышей, массой 18-20 г, вызванного введением под апоневроз задних лап 50 мкл 1 % раствора формалина или 50 мкл 0,1 % раствора гистамина; и на модели перитонита у крыс, массой 140-150 г, воспроизводимого по методу [11], путем внутрибрюшинного введения 0,2 % раствора азотнокислого серебра в дозе 1 мл/100 г массы животного, в сравнении с эффектами Эскузана. О противовоспалительном действии Ангионорма судили по степени торможения отека по отношению к контролю при внутрижелудочном введении препарата в дозах 20 и 100 мг/кг: в первом случае за 1 час до введения флогистиков и через 1 час после; во втором случае - через 1 час после введения AgNO₃.

Ангиопротекторные свойства Ангионорма изучали: 1). по методу [12] на мышах массой 18-20 г и крысах массой 180-200 г.; 2). по методу Свингле и др. (1971) [13] на морских свинках-альбиносах массой 280-320 г. с использованием ультрафиолетового облучения кожи, в сравнении с эффектами Эскузана. В 1-м случае препарат вводили внутрь однократно в дозах 20 и 100 мг/кг за 1 час до внутрибрюшинного введения 250 мкл 1 % раствора трипановой сини. Критерием сосудистой проницаемости служило время выхода сини в очаг воспаления, вызванного нанесением на депиллированную поверхность кожи животных 50 мкл ксилола. Во 2-м случае Ангионорм вводили животным внутрь в дозах 20 и 100 мг/кг в течение 4-х суток одновременно с местным нанесением 1 и 5% растворов препарата на поверхность кожи. Инсоляцию вызывали УФ облучением кожи с длиной волны 280 нм с расстояния до поверхности кожи 10 см в течение 60 сек и с расстояния 60 см – 15 мин. Выраженность гиперимии регистрировали в конце эксперимента через 5 часов после инсоляции по 5-ти балльной шкале.

Анальгетические свойства Ангионорма изучали на белых беспородных мышах обоего пола массой 18-20 г. путем определения порога болевой чувствительности (ПБЧ): по методике “горячая пластинка” [14] с использованием стандартной установки фирмы “UGO Basile” (Италия); и на модели “уксусно-кислые корчи” [15]. В 1-м случае, при температуре пластинки 54,5 ⁰С определяли ПБЧ животных - время наступления реакции дискомфорта (отдергивание лап, вертикальная стойка, "умывание"). Регистрацию времени наступления поведенческих реакций проводили через 30, 60, 120, 180 и 240 мин после однократного внутрижелудочного введения препарата в дозах 20 и 100 мг/кг. Во втором случае болевую реакцию воспроизводили путем внутрибрюшинного введения 0,25 мл 0,75% раствора уксусной кислоты через 30 мин после внутрижелудочного введения препарата в дозах 20 и 100 мг/кг. ПБЧ определяли в течение 20 минут с момента введения агента. О наличии анальгезирующего действия у Ангионорма судили по его способности уменьшать количество корчей в сравнении с контрольной группой животных, получавших воду.

Диуретические свойства Ангионорма изучали на фоне водной нагрузки на белых беспородных крысах-самцах массой 200-250 г согласно методике [16] при его однократном внутрижелудочном введении в дозах 20 и 100 мг/кг.

Гастропротективные свойства Ангионорма изучали на белых беспородных крысах обоего пола массой 200-220 г. при его внутрижелудочном введении в дозе 10 мл/кг. Противоязвенное действие препарата исследовали на моделях экспериментальных язв желудка, вызванных ульцерогенными агентами с различным механизмом повреждающего действия: этаноловые язвы [17] и кофеиново-мышьяковистые язвы [18]. В 1-м случае Ангионорм в дозах 20 и 100 мг/кг вводили крысам внутрижелудочно дважды за 2 и за 1 час до введения per os 80% раствора этанола (1 мл/крысу). Контрольные животные получали аналогичное количество 80% этанола. Во втором случае Ангионорм в дозах 20 и 100 мг/кг вводили животным натощак, ежедневно в течение 10-ти дней, за один час до введения кофеиново-мышьяковистой смеси. Контрольные крысы получали внутрь ульцерогенную смесь в объеме 1,0 мл/100 г массы тела. В обоих сериях экспериментов через 1 час после заключительного введения животных забивали. Для оценки защитного действия Ангионорма на слизистую оболочку желудка учитывали общее количество язв, процент крыс с язвами, среднюю частоту возникновения язвенных дефектов. По данным показателям вычисляли индекс Паулса - интегральный параметр противоязвенной активности [19].

Установлено, что Ангионорм достоверно и дозозависимо ингибировал агрегацию тромбоцитов человека in vitro при использовании в качестве проагреганта как АДФ, так и коллагена (Табл.1). 100%-ное ингибирование коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов наблюдалось при концентрации препарата 5,0 мг/мл.

Влияние Ангионорма на агрегацию тромбоцитов человека

in vitro (Аmax, M±m, %)

* или ** - достоверность отличий от контроля при p<0,05 или p<0,01

В условиях экспериментов in vivo, Ангионорм уже через 1 сутки после первого введения в дозе 100 мг/кг резко (в 3,2 раза, p<0,01) подавлял выраженность межтромбоцитарного взаимодействия, инициированного коллагеном, причем этот эффект сохранялся в течение всех 14 суток введения препарата (Табл.2). Через 7 дней после его отмены величина агрегации возвращалась к исходным значениям.

Таблица 2

Влияние Ангионорма на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов

кроликов при многократном введении в дозе 100 мг/кг (Аmax, M±m, %)

* или ** - достоверность отличий от исходного уровня при p<0,05 или p<0,01

Экспериментальные исследования показали, что Ангионорм проявляет выраженную противовоспалительную активность, что выражалось в достоверном (на 14-41%) снижении выраженности формалинового и гистаминового отеков конечностей у мышей и уменьшении на 33% и 54% количества воспалительного экссудата в брюшной полости у крыс по сравнению с контролем (Табл. 3). Активность Эскузана в тех же условиях экспериментов была ниже, чем у Ангионорма.

Одним из механизмов развития воспалительного отека является увеличение проницаемости сосудов. Проведенные исследования показали (Табл. 4.), что Ангионорм в дозах 20 и 100 мг/кг достоверно на 30,8 и 49,0 %% (мыши), 66,2 и 94,4 %% (крысы) и 10,7 и 14,5 (морские свинки) уменьшает проницаемость сосудов в очаге воспаления, т.е. обладает капилляропротекторными свойствами. Эскузан по изучаемому показателю был несколько активнее Ангионорма в опытах на мышах, но менее активен - в опытах на крысах.

Влияние Ангионорма и Эскузана на воспалительный отек конечностей

у мышей и экспериментальный перитонит у крыс

* или ** - достоверность отличий от контроля при p<0,05 или p<0,01

Таблица 4.

Влияние АНГИОНОРМА на проницаемость сосудов кожи

у мышей, крыс и морских свинок

* или ** - достоверность отличий от контроля при p<0,05 или p<0,01

Механизм развития болевого синдрома при термическом воздействии включает в себя эмоциональную реакцию на боль - в этой модели боли ведущую роль играют центральные механизмы. Показано, что в условиях “горячей пластинки” введение Ангионорма (20, 100 мг/кг) увеличивало ПБЧ на 24-53%% на протяжении четырех часов эксперимента по сравнению с исходным уровнем (Табл. 5), причем обезболивающий эффект возрастал с увеличением дозы.

В условиях модели химического раздражения уксусной кислотой тканей брюшной полости у мышей введение Ангионорма также приводило к увеличению ПБЧ: если в контроле количество “корчей” составило 40,24±1,73, то в группах животных, получавших Ангионорм в дозах 20 и 100 мг/кг, этот показатель составил 36,74±2,1 и 33,05±2,07 (p<0,05) соответственно.

Влияние Ангионорма на порог болевой чувствительности у мышей

на модели “горячая пластинка”

* - достоверность отличий от исходного уровня при p<0,05

Ангионорм достоверно усиливал стимулированный водной нагрузкой диурез у крыс, причем эффект возрастал с увеличением дозы препарата: суммарный (за 5-ть часов) диурез увеличивался с 124 % (20 мг/кг) до 150 % (100 мг/кг) по сравнению с контролем (Табл. 6).

Таблица 6.

Влияние Ангионорма на диурез у крыс

* или ** - достоверность отличий от контроля при p<0,05 или p<0,01

Внутрижелудочное введение препарата животным до или на фоне действия ульцерогенных агентов оказывало защитное действие на слизистую желудка крыс (Табл 7). Так, на модели этаноловых язв у крыс введение Ангионорма приводило к уменьшению на 11,5-76,8 %% степени изъязвления и средней площади язвенной поверхности слизистой по сравнению с контролем. В условиях модели кофеиново-мышьяковистого поражения слизистой желудка крыс вышеперечисленные показатели снижались еще более заметно - на 66,7-81,1 %%; индекс Паулса уменьшался более чем в 4 раза по сравнению с контролем.

Таблица 7.

Влияние Ангионорма на экспериментальные язвы желудка у крыс

* или ** - достоверность отличий от контроля при p<0,05 или p<0,01

Таким образом, показано, что Ангионорм обладает комплексом фармакологических свойств, среди которых основными являются - антиагрегационные, противовоспалительные и ангиопротекторные. Результаты проведенных опытов позволили установить, что Ангионорм обладает достаточно заметным действием на клеточное звено гемостаза. Это подтверждается антиагрегационным эффектом препарата, отмеченным как в условиях in vitro, так и in vivo. Сочетание капилляропротективного и противовоспалительного эффектов способствует проявлению венотонизирующей активности, а установленный для Ангионорма диуретический эффект усиливает его противоотечное действие. Косвенным подтверждением противовоспалительного действия препарата являются данные о его выраженном защитном действии на слизистую оболочку желудка. анальгетических, гастропротективных и диуретических. Заметные анальгетические и диуретические свойства Ангионорма служат ему дополнительной положительной характеристикой.

Широту фармакологических свойств препарата обуславливает многообразие фармакологических свойств экстрактов из растений, входящих в его состав. Так, солодка обеспечивает антиагрегационный и противовоспалительный эффекты препарата [20, 21], каштан – ангиопротективное, венотонизирующее и противовоспалительное действие [22]. Также необходимо отметить, что по составу компонентов и профилю фармакологической активности Ангионорм имеет сходство с применяемым в медицинской практике лекарственным растительным сбором "Касмин". Известно, что Касмин обладает отчетливой антиагрегационной и антикоагуляционной активностью, а также умеренными гастропротективными, диуретическими, гиполипидемическими, седативными свойствами, и разрешен к медицинскому применению в качестве антитромботического средства при хронической венозной недостаточности, лимфостазе, а также для профилактики атеросклероза [23].

Выраженная фармакологическая активность Ангионорма в сочетании с высоким уровнем безопасности, установленной при экспериментальном доклиническом изучении его переносимости, обусловливают возможность рекомендовать его в качестве лечебно-профилактического антиагрегационного, капилляропротективного, венотонизирующего и улучшающего микроциркуляцию средства для лечения острых патологических состояний и/или обострений хронических заболеваний, связанных с сосудистыми нарушениями, такими как повышение агрегации тромбоцитов (тромбозы сосудов, тромбоэмболии), нарушение проницаемости капилляров, микроциркуляции и венозного кровообращения (варикозное расширение вен, постромботический синдром, тромбофлебиты, тромбозы капилляров). Разработана лекарственная форма Ангионорма – таблетки по 0,1 г покрытые оболочкой.

1. Moser K.M. (1990) Am. Rev. Respir. Dis.-1990.- V.141.-P.235-249

2. Балуда В.П. и др. Профилактика тромбозов. Саратов.-1992.-С.111-119.

3. Макаров В.А. //Казан. мед.ж.-1988.-Т.69.-№5.-С.383-386.

4. Панченко Е.П. //Клин. фармакол. и терапия.-1998.-Т.7.-№5.-С.1-13.

5. Beretz A., J.-P.Cazenave (1991) Planta Med.-1991.-V. 57.-P.68-72

6. Большая российская энциклопедия лекарств. М.: Ремедиум.-2001.-С.167, 490.

7. Яблоков Е.Д. и др. //Терапевт. Архив.-1996.-Т.68.-№10.-С.80-81.

8. Rehn D., Unkauf M. et al. //Arzneimitt.-Forsch. Drug. Res.-1996.-V.46.-P.483-487.

9. Renton S. et al.//Int. Angiol.-1994.-V.1313.-P.259-262.

10. Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д. и др. Лабораторные методы исследования системы гемостаза. М: Медицина.-1980.

11. Либерман С.С., Кутчак С.Н., Рудзит Е.А., Шахназарова Н.Г.//Фармакол. и токсикол.-1972.-Т.35.-N 3.-С.333-334.

12. Ойвин И.А., Монахова К.Н.//Фармакол. и токсикол.-1953.-Т.16.-N 6.-С.50-51.

13. Гацура В.В.//Методы первичного фармакологического исследования биологически активных веществ.-М.-1974.

14. Gomaa A.A.//Acta Pharmacol. et Toxicol.-1985.-V.57.-P.18.

15. Cashin C.H. et al. //J. Pharm. Pharmacol.-1977.-Vol.29.-P.330-336.

16. Берхин Е.Б. Мочегонные средства. М:Медицина.-1967.-C.199.

17. Robert A., Nejamis J.E., Lancaster C. et al.//Am.J.Physiol.-1983.-V.245.-P.113-121.

18. Мещерская К.А.//Фармакол. и токсикол.-1954.-Т.17.-N.5.-С.26.

19. Pauls F., Wick A.N., MacKay E.M. //Gastroenterol.-1947.-V.8.- P.774-782.

20. Колхир В.К.Исследование влияния некоторых тритерпеновых гликозидов на свертывающую систему крови.- Дисс.к.м.н., М.-1983.

21. Francischetti I.M., Monteiro R.Q., Guimaraes J.A. //Biochem.Biophys. Res. Commun.-1997.-235.-P.259-263.

22. Ладынина Е.А., Морозова Р.С. Фитотерапия. Л.: Медицина.-1990.-С.288.

23. Колхир В.К., Майнсков А.В., Сакович Г.С. и др. Труды Всеросс. науч.-исслед. ин-та лекарств. и аромат. растений, раздел " Химия, технология, медицина".-2000.-С.273-281.